Μέθοδος μέτρησης της αφλατοξίνης του καλαμποκιού
Η αφλατοξίνη, που συντομογραφείται ως AFT στα αγγλικά, είναι μια ένωση που αποτελείται από έναν δακτύλιο difuranyl και κουμαρίνη (οξαναφθοκινόνη).,με μοριακό βάρος 312-346 και σημείο τήξης 200-300 °C. Έχει σταθερές και ανθεκτικές σε υψηλές θερμοκρασίες ιδιότητες και μπορεί να παράγει φθορισμό κάτω από υπεριώδες φως μεγάλων κυμάτων.Είναι χωρισμένο σε Β1, Β2, G1, G2, M1, M2, P1, R1, GM και τοξικές αλκοόλες σύμφωνα με διαφορετικά χρώματα φθορισμού, τιμές ραδιοσυχνοτήτων και δομές.
Το AFT είναι αδιάλυτο σε νερό, αιθάνιο, αιθέρα και αιθέρα πετρελαίου, αλλά εύκολα διαλυτή σε οργανικούς διαλύτες όπως μεθανόλη, αιθάνιο, χλωροφόρμα, ακετονιτρίλιο και διμεθυλοφορμαμίδιο.Το AFT μπορεί να αποσυντίθεται ελαφρώς σε όξιους διαλύτες με pH 1-3, αποσυντίθενται και αποσυντίθενται γρήγορα σε διαλύματα με pH 9-10, αποσυντίθενται γρήγορα όταν εκτίθενται σε αλκαλικά και αποσυντίθενται σε σχεδόν μη τοξικά άλατα σε αλκαλικά διαλύματα με pH 9-10.Μπορεί να μειωθεί σε όξιες συνθήκες..
Στόχος του πειράματος
Η αφλατοξίνη αναφέρεται σε ορισμένες εξαιρετικά τοξικές καρκινογόνες ουσίες που παράγονται από μύκητες.συνηθισμένα συμπτώματα ηπατικής δυσλειτουργίας όπως πυρετόςΗ μακροχρόνια έκθεση σε χαμηλές δόσεις (20 μικρογραμμάρια/ kg σωματικού βάρους) μπορεί να αυξήσει σημαντικά τον κίνδυνο καρκίνου του ήπατος, καρκίνου του στομάχου και άλλων ασθενειών.Καθώς υπάρχει ευρέως στις καλλιέργειες και τα τρόφιμα και προκαλεί μεγάλη βλάβη στους ανθρώπους και τα ζώα, η καθιέρωση ταχείων και ακριβών μεθόδων ανίχνευσης έχει μεγάλη σημασία για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων και της δημόσιας υγείας.
Σκοπός του παρόντος πειράματος είναι να χρησιμοποιηθεί η αρχή της δοκιμής ανοσοσυμπίεσης ενζύμου στερεής φάσης (ELISA), δηλαδή της δοκιμής ανοσοσυμπίεσης ενζύμου (ELISA),για τον περιορισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό της περιεκτικότητας της αφλατοξίνης Β1 στα δείγματα, παρέχοντας επιστημονική βάση για την εκτίμηση του κινδύνου μόλυνσης τροφίμων.
Πειραματικές συσκευές
1 αναλυτής μυκοτοξινών ST-2000A
2 Σίτη, ομογενοποιητής, συσκευή ξήρανσης αζώτου, ταλαντωτής, φυγοκέντρωση, βαθμιαία πιπέτα, ζυγαριά (ευαισθησία 0,01g), μικροπιπέτα, αντιδραστήρας μεθανόλης, n-εξανού, χλωροφόρμου ή διχλωρομεθανίου
Πειραματική διαδικασία
1 Ελέγξτε τον εξοπλισμό που χρησιμοποιείται στο πείραμα για να βεβαιωθείτε ότι είναι καθαρός, ξηρός και απαλλαγμένος από μόλυνση
2 Αναμειγνύεται μεθανόλη και αποιονισμένο νερό σε αναλογία 7:3 για να παρασκευαστεί το διάλυμα εκχύλισης δείγματος
3 Πάρτε 2g δείγμα σπασμένου καλαμποκιού και τοποθετήστε το σε σωλήνα φυγοκέντρωσης 50 ml. Προσθέστε 5ml διάλυμα εκχύλισης δείγματος και ανακινήστε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 4000 rpm για 10 λεπτά.Πάρτε 0.5 ml υπερυψωτικού και προσθέστε 0.5 ml αποιονισμένου νερού.
4 Απομακρύνετε τα απαιτούμενα αντιδραστήρια από το ψυγείο θερμοκρασίας 4 °C, αφήστε τα να ισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και ανακινήστε καλά.και αραιώστε 20 φορές το συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης με αποιονισμένο νερό για να γίνει το λειτουργικό διάλυμα πλύσης.
5 Αριθμήστε τα αντίστοιχα μικροπόρια του δείγματος και του προτύπου κατά σειρά, κάντε 2 παράλληλα πηγάδια για κάθε δείγμα και προτύπο και καταγράψτε τις θέσεις των προτύπων και των δειγματοληπτικών πηγών.Προστίθενται 50 μl/βρύσμα πρότυπου ή δείγματος στους αντίστοιχους μικροπόρους τους, στη συνέχεια προστίθενται 50 μl/βρύση ενζύμου- δείκτη και στη συνέχεια προστίθενται 50 μl/βρύση εργασιακού διαλύματος αντισωμάτων.Αντιδράσεις σε θερμοκρασία 25 °C για 30 λεπτά.
Αφαιρέστε το καπάκι, κουνήστε το υγρό μέσα στην τρύπα και πλύνετε προσεκτικά 5 φορές με 250 μl απορρυπαντικού εργασίας ανά τρύπα, με διάστημα 30 δευτερολέπτων ανάμεσα σε κάθε πλύση.Χρησιμοποιήστε απορροφητικό χαρτί για να στεγνώσετε
7 Προσθέστε σε κάθε πηγάδι διάλυμα υποστρώματος Α (50 μl), ακολουθούμενο από διάλυμα υποστρώματος Β (50 μl).
Προσθέστε 50 μl διαλύματος τερματισμού σε κάθε πηγάδι, κουνήστε απαλά και ανακατέψτε καλά για να τερματιστεί η αντίδραση.
9 Μετρήστε την τιμή απορρόφησης κάθε πηγάδι στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναλυτή αφλατοξίνης (συστήνεται διπλό μήκος κύματος 450/630 nm).Η μέτρηση πρέπει να ολοκληρώνεται εντός 10 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης.
10 Το όργανο ολοκληρώνει τη μέτρηση και παρέχει αυτόματα το αποτέλεσμα
Πειραματικά αποτελέσματα
Μετά την εξέταση, η περιεκτικότητα του δείγματος σε αφλατοξίνες είναι περίπου 0,19ug/kg, η οποία πληροί το GB 2761-2017 "Εθνικό Πρότυπο Ασφάλειας Τροφίμων για τα όρια των μυκητιασικών τοξινών στα τρόφιμα".